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          實驗新手系列:關于wb實驗

          更新時間:2019-08-16      點擊次數:4207

          一、實驗過程中需要注意的問題

          ①蛋白樣品的提取及蛋白含量的檢測

           蛋白樣品的提取咱們*是按照試劑盒說明書來做的,步驟沒有什么講的,但是因為蛋白樣品的好壞直接決定了是否能做出來蛋白條帶,這就好比蓋房子所需要的磚頭一樣,一定要務必認真。

          ②儀器準備

           清洗玻璃板:玻璃板的正確拿法應該是拿住玻璃板的左右兩側不要用手拿上下兩端,避免手套上面的臟東西順著水流流到玻璃板上,玻璃板請一定務必清洗干凈,不干凈的玻璃板上面的殘留物可能會影響凝膠之間的化學反應,導致膠出現問題,對后面的結果影響很大。

           玻璃板放置:玻璃板底部對齊,垂直放入夾子中間加緊,高的在后,矮的在前。

          3凝膠配置

           根據蛋白分子量的大小選擇合適濃度的分離膠,可參考凝膠配置試劑盒中說明書或者參考別人的文獻。配膠的APS需要在4度冰箱保存。注意配膠的時候膠一定一定要混勻,配膠的試劑中APS與TEMED是促凝劑,所以在加促凝劑之前先把其他組分混勻,可用*吹打也可用手腕去甩,向左甩n次再向右甩n次,或者用咱們實驗室的混勻的那個儀器混勻,名字我給忘了,那個效果好產生的氣泡很少而且節省人力。。。

          ④將配置好的分離膠沿著玻璃板一側緩慢打入玻璃板中,這個時候不用擔心打入氣泡,灌入合適量的分離膠之后,加入適當劑量的ddWater或者異丙醇封膠(加入封膠試劑量沒有規定,蓋住整個分離膠膠面即可)

          5上樣

          A. marker孔加入5微升,其余蛋白孔上樣10微升左右,不要加的太多,這個后面會做說明。

          B. 電泳儀及轉膜儀請務必確定正負極是否對準確,不要犯低級錯誤。

          ⑥電泳

           這個沒有具體的時間限制,只要分子量小的蛋白跑到膠的底部即可。在電泳過程中是否需要進行壓膠還是直接恒壓跑到底這個問題后面說明。電泳開始的時候開制冰機制冰,為后面的轉膜做準備。

          ⑦轉膜

          A. 電泳快結束的時候就可以配置轉膜液(轉膜液室溫20-30度不宜放過長時間,幾天內用可以室溫放置,如果時間太長可放入4度冰箱保存)

          B. 根據自己的蛋白位置選擇合適的位置切膠,切膠過程中保持膠的濕潤(用蒸餾水不定時潤濕),因為膠一旦干了脆性增強,很容易斷。

          C. 根據膠的大小選擇合適大小的膜,膜和膠相同大小或者略小于膠,并且膠面和膜之間不能有氣泡,大多數人認為如果膜大于膠會使得轉膜過程中膠面短路,一是使得局部的蛋白不能轉到膜上去,二是短路會使得局部溫度過高(熱量=U2/R*t)凝膠受熱變形,轉到膜上的蛋白歪七扭八,但是丁香園里面有大神說過氣泡對于轉膜影響不大,我沒試驗過。。

          D. 膠,膜,濾紙,海綿放置成三明治結構,一旦放好不要亂動,否則對齊的膠和膜之間位置會有偏移。

          A. 選擇合適的轉膜時間進行轉膜,至于轉膜是選擇橫流還是恒壓后面詳細贅述,整個轉膜過程,轉膜儀需放置在冰水混合物中進行。

          ⑧抗原抗體反應

          A. 麗春紅染色??(是否需要麗春紅染色以及什么情況下需要麗春紅染色后面介紹)

          B. 剪膜:根據自己的蛋白位置進行剪切

          C. 洗膜  5min/3次

          D. 封閉  選擇適當的封閉液進行封閉(脫脂奶粉或者牛血清白蛋白)封閉多長時間?這個后面介紹

          E. 一抗過夜孵育F. 洗膜  5min/3次

          G. 二抗孵育 室溫一小時

          H. 洗膜  5-10min/3次

          ⑨ECL發光成像

             ECL發光液A液與B液1:1混合,將發光液滴到膜上曝光觀察,若是對同一張膜進行其他蛋白曝光處理,可用一抗二抗洗脫液洗脫后重新一抗二抗孵育處理,若是對同一蛋白進行重新曝光則不需要。

           

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